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哪些因素影响酶联免疫试剂盒试验结果?
发布时间:2018-05-25 阅读:160
    酶联免疫试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被小鼠叶酸(folic acid)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠叶酸(folic acid)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。那么,哪些因素影响酶联免疫试剂盒试验结果呢?
    一、抗原
    在酶联免疫试剂盒试验中,包被于固相载体表面的抗原或抗体的来源和制备方法对试验结果都有影响。包被所用的抗原必须是可溶性的,且要求是优质和稳定的制剂,纯度和免疫原性要高。而且抗原包被固相载体除浓度外,对时间、温度、PH 均有关系。
温度高(如 37 ℃、45 ℃、或 56 ℃),包被时间可缩短,温度低可延长包被时间。但为了方便起见,通常采用 4℃ 包被过夜,可使抗原吸附得更加完全且均匀。
    在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反应板或塑料管作固相载体时,在碱性条件下(如 0.1 mol/L、PH 9.6 碳酸盐缓冲液稀释抗原)4 ℃ 包被过夜较为合适。
但在某些试验中,如用 LPS 或毒素蛋白包被时,用 PH 7.2~7.4 PBS 稀释才是满意的。包被特异蛋白质的浓度为 1~10 ug/ml,而对某些病原微生物抗原以 5~20 ug/ml 较为合适,但均应通过滴定。
    二、固相载体
    可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式,这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体,但在酶联免疫试剂盒试验中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。
    每批制品在使用前,须经过实验室鉴定,鉴定的方法和标准是对每批购置的微量反应板或塑料管抽样,用 0.2 ug/ml 纯化的正常人IgG进行包被,经洗涤后加酶标记抗人球蛋白进行反应,再经孵育洗涤,加底物显色终止反应后,逐孔在酶标比色计中测定其消光值、光密度(OD值)。
    一般认为全板中每两孔间OD值的误差不超过 10% 为合格。如果中间孔与四周孔OD值相差太大,或者反应板的这一边与另一边凹孔的OD值相差大,均不合格。此外,还要检查阳性和阴性参考血清OD值是否有明显差别。一般要求有10 倍左右的差异为合格。


 
 
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